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前言 采用高性能尺寸排阻色谱法(GFC或SEC)进行多肽分离,操作简便,不仅可用作检测分子量的手段,还可作为纯化多肽与蛋白质分解产物如多肽片断的方法之一。可与反相色谱法(RPC)及离子交换色谱法(IEC)联用。同时,在临床上还通过把GFC进行比较,来推测病程的进展。   1所示为TSKgel色谱柱在采用GFC法进行多肽分离的相关文献及其概要。

一般情况下,采用GFC法分离多肽所使用的填充剂多为TSKgel的SW硅胶型填料而非TSKgel的PW树脂型填料。本文中将针对这些填充剂(TSKgel G2000SWXL以及TSKgel G2500PWXL)在多肽分离的应用上进行探讨。     实例应用

1)标准多肽的分离 表2所示为各多肽标准液的洗脱体积,图1所示为标准曲线。洗脱液采用含有45%乙腈的0.1%TFA溶液。所有TSKgel G2000SWXL的样品洗脱速度均慢于TSKgel G2500PWXL。同时,在TSKgel G2000SWXL中,肌球蛋白(MW17800)进入填充剂的小孔内部,但在TSKgel G2500PWXL中,肌球蛋白被小孔排阻,从外水体积中被洗脱。根据其结果,可认为TSKgel G2500PWXL在上述洗脱液条件下的多肽分子量排阻界限推测为8000,相比之下,硅胶型填充剂TSKgel G2000SWXL,可适用于从低分子量到高分子量区域更广的范围。 另一方面,如样品分子量低于3000,TSKgel G2500PWXL显示的标准曲线与TSKgel G2000SWXL几乎趋于相同,分离范围非常接近。但是,对比各多肽的洗脱体积,两者尚存有微妙的区别(尤其是亮氨酸脑啡肽),这是由于在分离过程中样品与填充剂之间的相互作用(离子性、疏水性的相互作用等)而造成的影响。

23所示为TSKgel G2500PWXLTSKgel G2000SWXL在分离多肽标准品时的对比图。通过色谱图可以明确的看出,TSKgel G2000SWXL吸收峰形与分离带的宽度均更佳,因此其分离性能更为优异。另一方面,如果多肽的分子量小于1000,由于样品与填充剂之间的某些相互作用,使用TSKgel G2500PWXL时的分离效果要高于TSKgel G2000SWXL。例如图2中所示的后叶催产素(MW1007)与亮氨酸-脑啡肽(MW555)、以及图3所示的TRHMW362)与甘氨酸(MW75)均显示了其分离效果高于TSKgel G2000SWXL



如上所述,在整体上,TSKgel G2000SWXL具有更高的分离效果,但对于分子量低于1000的多肽样品,TSKgel G2500PWXL的分离效果会更佳。另外,由于TSKgel SW型硅胶填充剂不具有耐碱性,如样品需要在碱性条件下进行分离,或使用NaOH溶液进行色谱柱清洗时,请考虑使用TSKgel PW型色谱柱。     2)蛋白消化物的分离 4所示为分离基因重组ProteinATRCK-胰蛋白酶消化物的实例。样品中含有与蛋白质消化物分子量不同的各类多肽。如上所示,由于TSKgel G2000SWXL色谱柱的分离范围较宽,其分离效果也更好。(该样品通过RPC分析的结果,可观察到约有60种多肽峰在RPC下被检测到)。



总结 3所示为采用尺寸排阻色谱法进行多肽分离时,TSKgel色谱柱产品的不同性能。一般考虑采用TSKgel G2000SWXL较为适合,但考虑到填充剂的耐碱性与多肽的分子量大小等因素,也可根据情况而选择使用TSKgel G2500PWXLTSKgel G3000PWXL  
TSKgel 多肽、蛋白质的分子量区间范围 特征
TSKgel G2000SWXL 100-100000* 首选色谱柱 分离范围大 分离效果好
TSKgel G2500PWXL 100-5000 用于低分子量的多肽样品 具有耐碱性
TSKgel G3000PWXL 1000-50000 用于高分子量的多肽样品 具有耐碱性
*预估值

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